脫氫乙酸（DHA）是一種高效的防腐、防霉劑，在酸、堿條件下均有一定的抑菌能力，尤其對酵母、細(xì)菌、霉菌有較強(qiáng)的抑制能力，常用于果汁、醬菜、糕點(diǎn)、淀粉制品、肉制品、發(fā)酵豆制品、復(fù)合調(diào)味料等食品和食品添加劑防腐、防霉。但因其毒性及對人體健康的危害，對其含量的檢測日益受到人們的重視。本文針對DHA的多種檢測方法進(jìn)行闡述，旨在為DHA的檢測研發(fā)提供一定的參考。
脫氫乙酸學(xué)名3-乙?；?6-甲基-脫（2）氫吡喃-2，4脫（3）氫二酮，是繼苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯類之后又一代新的廣譜食品防腐防霉劑，它基本不受pH的影響，抑菌能力很強(qiáng)，尤其對酵母、細(xì)菌、霉菌有較強(qiáng)的抑制能力，常用于果汁、醬菜、糕點(diǎn)、淀粉制品、肉制品、發(fā)酵豆制品、復(fù)合調(diào)味料等食品和食品添加劑防腐、防霉。工業(yè)上還用于飼料、日用化妝品、纖維制品、醫(yī)藥以及齒科材料的防腐。但是脫氫乙酸半數(shù)至死量大鼠口服為1000mg/kg體重，大量食用脫氫乙酸對人體健康將產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。許多國家對脫氫乙酸在食品中的使用量都有明確的規(guī)定：日本規(guī)定其在食品中添加量不得超過0.5g/kg；美國規(guī)定其在食品中最高殘留限量為65mg/kg。我國《GB 2760-2011 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定：脫氫乙酸可用于果汁、醬菜、糕點(diǎn)、淀粉制品、肉制品、發(fā)酵豆制品等幾類食品，最大使用量為0.3～1.0mg/kg。因而，準(zhǔn)確地測定食品中脫氫乙酸的含量，有利于指導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)，規(guī)范企業(yè)行為；同時也有利于維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，減少不良危害。
檢測食品中脫氫乙酸的國標(biāo)方法有氣相色譜法、液相色譜法等，方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在多種樣品前處理方法上進(jìn)行改進(jìn)，并相對應(yīng)建立有效的氣相色譜、液相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等檢測方法，為今后食品中脫氫乙酸的檢測研發(fā)提供一定的參考。
1、氣相色譜法
該方法是在GB/T 5009.121-2003《食品中脫氫乙酸的測定》標(biāo)準(zhǔn)方法上進(jìn)行改進(jìn)：將樣品酸化后，用乙醚提取脫氫乙酸后濃縮，用氣相色譜（附氫火焰離子化檢測器）進(jìn)行分離測定，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。
1.1實(shí)驗(yàn)部分
1.1.1儀器與主要試劑
氣相色譜儀：GC-17（附氫火焰離子化檢測器 FID），譜析科學(xué)儀器公司。
脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.6%，購自美國。
乙醚：色譜純，重蒸。
丙酮：色譜純，重蒸。
脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品50mg，以丙酮溶解定容于50mL容量瓶中，再以丙酮分別稀釋至1μg/mL、10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL 120μg/mL、160μg/mL 200μg/mL，配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
色譜條件：
色譜柱：DB-5毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；
分流比：10：1，柱流速1.0mL/min
進(jìn)樣口溫度：250℃、檢測器溫度：300℃、柱溫165℃；
氣流條件：氫氣50mL/min、空氣400mL/min、氮?dú)?0mL/min。
應(yīng)用上述色譜條件，脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，色譜圖如下：
1.1.1樣品處理
稱取5～10g試樣（準(zhǔn)確至0.0001g），加10mL飽和氯化鈉溶液，2mL鹽酸溶液（1+1）酸化，分別以50mL、20mL、20mL乙醚提取三次，合并乙醚層于100mL容量瓶中定容后，分別用20mL飽和氯化鈉溶液、50mL碳酸氫鈉溶液（10g/L）各洗滌一次，加10g無水硫酸鈉，室溫下放置30min，取50mL在60℃水浴下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，用丙酮定容后供氣相色譜測定。
1.1方法討論
1.1.1色譜條件的選擇
脫氫乙酸用氣相色譜法測定，與其他同類功能的防腐劑如山梨酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸酯類都有很好的分離度，且在非極性柱、弱極性柱和極性柱中都有很好的響應(yīng)值。但在實(shí)驗(yàn)顯示，脫氫乙酸在非極性柱中因低柱溫有色譜峰拖尾現(xiàn)象，在極性柱中因柱流失有基線漂移現(xiàn)象，為使定性定量準(zhǔn)確，選用了弱極性柱DB-5。
1.1.1線性關(guān)系
在本實(shí)驗(yàn)條件下，脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.5～100μg/mL范圍內(nèi)與響應(yīng)值峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.99995。脫氫乙酸的最低檢出濃度為0.2μg/mL。
1.1.1準(zhǔn)確度與精密度
選用含脫氫乙酸的辣椒醬樣品，在樣品中添加不同濃度的脫氫乙酸標(biāo)液，按本方法測定，每一濃度重復(fù)測定6次，取平均值，計算平均回收率及變異系數(shù)，結(jié)果見下表。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法回收率滿意，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍小于10%，重復(fù)性好，符合檢測要求。
加標(biāo)濃度（mg/kg） 平均回收率（%） 精密度 RSD（%） 1.0 83.2 6.8 5.0 89.6 5.6 10.0 90.3 4.7 30.0 91.6 3.6 50.0 102.4 3.4
2、液相色譜法
該方法是在GB/T 23377-2009《食品中脫氫乙酸的測定 高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)方法上進(jìn)行改進(jìn)：用氫氧化鈉溶液提取試樣中的脫氫乙酸，經(jīng)脫脂、去蛋白處理后，用高效液相色譜紫外檢測器測定，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。
2.1實(shí)驗(yàn)部分
2.1.1儀器與主要試劑
液相色譜儀：LC-3000（二級管陣列檢測器 DAD），譜析科學(xué)儀器公司。
脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.6%，國標(biāo)公司。 甲醇：色譜純。
乙酸銨溶液（0.02mol/L）：分析純，稱取1.54g乙酸銨用氨水（1+1）調(diào)節(jié)pH至9.0，加水至1000mL溶液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾。
2.1.2色譜條件
色譜柱：ECOSIL-C18柱 （5μm，250mm×4.6mm）；
流動相：甲醇+0.02mol/L乙酸銨（5+95，v/v）
流速：1.0mL/min
柱溫：40℃
檢測波長：293nm
應(yīng)用上述色譜條件，脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，色譜圖如下：
2.1.3樣品處理
稱取5～10g試樣（準(zhǔn)確至0.0001g），加50mL水，用氫氧化鈉溶液（8g/L）調(diào)節(jié)pH至7.2，加入5mL乙酸鋅溶液（220g/L），5mL亞鐵氰化鉀溶液（106g/L），超聲提取40min，定容至100mL，靜置30min過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。
2.2方法討論
2.2.1色譜條件選擇
在GB/T 23377-2009國標(biāo)方法中，流動項(xiàng)的選擇為甲醇+0.02mol/L乙酸銨（10+90，v/v）。在實(shí)際樣品的檢測中，考慮到食品中其他添加劑對于脫氫乙酸檢測（如山梨酸、糖精鈉等）的影響，能過對不同比例流動相的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)流動相比例為甲醇+0.02mol/L乙酸銨（5+95，v/v）優(yōu)于國標(biāo)方法條件，結(jié)果見下表。
2.2.2線性關(guān)系
在本實(shí)驗(yàn)條件下，脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.5～100μg/mL范圍內(nèi)與響應(yīng)值峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.99999。脫氫乙酸的最低檢出濃度為0.1μg/mL。
2.2.3準(zhǔn)確度與精密度
參照1.2.3，選用同一辣椒醬樣品，按本方法測定，做加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每一濃度重復(fù)測定6次，結(jié)果見下表。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法回收率滿意，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍小于10%，重復(fù)性好，符合檢測要求。
3、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法
目前尚無氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定食品中脫氫乙酸的國標(biāo)方法，筆者是根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)建立的方法：試樣經(jīng)乙醚提取，用氣相色譜進(jìn)行分離，特征離子峰進(jìn)行定性定量。
3.1實(shí)驗(yàn)部分
3.1.1儀器與主要試劑
氣質(zhì)聯(lián)用儀：GCMS-7890A-5975C，美國安捷倫公司。
脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.6%，購自美國。
正已烷：分析純。
乙醚：色譜純，重蒸。
脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品50mg，以乙醚溶解定容于50mL容量瓶中，再以乙醚分別稀釋至1μg/mL、10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL 120μg/mL、160μg/mL 200μg/mL，配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
3.1.2色譜條件
載氣：高純氦氣（99.999%）；
色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；
柱流速：1.0 mL/min；
汽化室溫度：250℃、柱溫程序：初始溫度150℃，保持0.5min，以10℃/min速率升溫至180℃，保持6min。
3.1.3 質(zhì)譜條件
傳輸線溫度：220℃；離子源溫度：200℃；離子化方式：EI；電子能量：70eV；延遲時間2.0 min；檢測方式：全掃描，質(zhì)量范圍：m/z 25～300。
應(yīng)用上述質(zhì)譜條件，脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，質(zhì)譜圖如下：
3.2.1樣品處理
稱取5～10g試樣（準(zhǔn)確至0.0001g），加35mL水、2mL氫氧化鈉溶液（20g/L），超聲提取20 min，用水定容至50mL，加10mL正己烷提取一次，棄去正己烷層，再加1mL鹽酸（1+1）酸化，準(zhǔn)確加入10mL乙醚振搖5min，靜置10min，取上清液供質(zhì)譜測定。
3.2方法討論
3.2.1質(zhì)譜條件的選擇
根據(jù)脫氫乙酸在氣相色譜上的良好響應(yīng)情況，用質(zhì)譜測定時，仍選用的弱極性柱DB-5MS柱。檢測方式選擇全掃描、選擇離子掃描皆可，本文選擇了全掃描。
3.2.2線性關(guān)系
在本實(shí)驗(yàn)條件下，脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.5～100μg/mL范圍內(nèi)與響應(yīng)值峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.99997。脫氫乙酸的最低檢出濃度為0.2μg/mL。
3.2.3準(zhǔn)確度與精密度
選用同一辣椒醬樣品，按本方法測定，做加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每一濃度重復(fù)測定6次，結(jié)果見下表。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法回收率滿意，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍小于10%，重復(fù)性好，符合檢測要求。
4、結(jié)論
本文探討的三種方法，分離度好，回收率較好，都是食品中脫氫乙酸含量的良好檢測方法。相比較而言，氣相色譜法與干擾物質(zhì)的分離度好，但樣品前處理較復(fù)雜；液相色譜法樣品前處理簡便，特征峰定性較差；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法樣品前處理較氣相色譜法簡便，定性較色譜更精準(zhǔn)，但儀器設(shè)備價格昂貴難以推廣。
