1、先檢查樣品是否過載
由于樣品過載引起的峰形后拖不能通過改變色譜條件消 除。如果發現過載,需降 低進樣量(包括進樣體積或濃度),進樣量越小,峰形越好,例子如頭孢尼西鈉的測定:
2、調節流動相pH
將流動相的pH調至比弱酸p Ka小2以上,比弱堿p Ka大2以上,可有 效抑 制易離子化待測物的電離,從而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的測定:
堿性化合物中,甲胺的p Ka為10.64,那么在pH< 8.64的時候它是完 全呈離子態的, 那么pH在2.5~8.64時,特 別是pH6.7~8.64時,此時甲胺和硅羥基均以離子狀態-NH3+和Si-O-形式存在的,它們之間相互吸引的靜電作用導致后拖,這就是為什么很多堿性化合物在pH 7.0的條件下容易產生拖尾的原因。而很多色譜柱生產商也因此以阿米替林(含-N(CH3)2,堿性比-NH2強)在pH 7.0的條件下來評價和比較不同色譜柱之間的優劣,該條件下的阿米替林的峰形越好說明封尾越好。而在pH
3、增加緩沖鹽或增 大緩沖鹽的濃度
流動相中加入緩沖鹽,增 強了流動相的離子強度,在-NH3+等及性基團和硅羥基Si-O-之間存在著許多離子的干擾,減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機會,有 助于削弱及性基團與硅羥基之間的相互作用,改 善峰形。這種適合于堿性較弱(如氨基的N原子與強吸電子基相連),或堿性很強,但在剛性結構中,比較難 以接近被C18長鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基,例子如高烏甲素的測定:
4、加入三乙胺、四丁基硫酸氫銨或辛烷磺酸鈉
拖尾的產生是因為-NH2、-NHR、-NR2與硅羥基發生靜電作用引起的,那么阻 礙它們之間靜電作用的途徑,應該有兩種,一種是占據硅羥基這個作用位點,另一種是占據-NH2、-NHR、-NR2這個作用位點。
在流動相中加入三乙胺,能顯 著的改 善峰形,消 除拖尾,其作用是屏蔽硅羥基。三乙胺的p Ka為11.09,在pH<11.09-2=9.09的條件下是以離子狀態N+H(CH2CH3)3的形式存在的,因此pH在2.5~8.64 硅羥基呈Si-O-離子態的情況下,N+H(CH2CH3)3容易與Si-O-形成相對較強的靜電吸引力。
加入三乙胺改 善峰形的時候,有兩點需要注意:1)三乙胺的堿性很強,加入三乙胺后流動相的pH可能操出 色譜柱的使用范圍,對色譜柱造成損商。pH的改變也會導致出峰時間的顯 著變化,可能引起的其它問題,建議流動相中加入三乙胺后回調至未加入前的pH值。通常即使pH回調過后,由于三乙胺成為了固定相的一部分,保留時間也有較大變化;2)三乙胺在210nm處有比較強的吸收,如果液相方法中檢測波長在210nm以下測定時需要謹慎使用。
四烷基季銨鹽(如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等)在水中電離后,也形成了類似N+H(CH2CH3)3的結構N+(CH2CH2CH2CH3)4 ,這種結構也能有 效的與Si-O-產生較強的靜電作用,阻止氨基與硅羥基的接觸,改 善峰形。而且它還有一個不同于三乙胺的顯 著特點是,它在低波長范圍的吸收比三乙胺弱。
流動相中加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對試劑也能很 好的改 善峰形,其作用機理與三乙胺和四丁基硫酸氫銨頗為不同,是通過與樣品分子的作用來阻止樣品分子與硅羥基的作用來改 善峰形。